Mehr noch als die Epitaphe des Chorraums zeigen die Grüfte der Stadtkirche, wie nah für die Menschen vergangener Jahrhunderte Tod und Leben zusammen gehörten. Ursprünglich gab es insgesamt vier Grabräume unter der Kirche: die seit 1687 genutzte Landgrafengruft im südlichen Teil der Kirche, die Grabstätten für Darmstädter Adel, Prominenz und Superintendenten unter dem Nordschiff und im Gewölbe unter der Turmhalle sowie die sogenannte „Fürstengruft“ unter dem Chorraum. Nur diese letztgenannte, älteste Gruft ist heute noch öffentlich zugänglich. Landgraf Georg I., Begründer des Hessen-Darmstädter Fürstenhauses, ließ sie 1576 für Beisetzungen der Fürstenfamilie anlegen. In zwei Räumen finden sich hier neben den Särgen Georgs I. ( 1596) und seiner beiden Ehefrauen Magdalena ( 1587) und Eleonore ( 1618) die Grabstätten vierzehn weiterer Landgrafen und -gräfinnen, Prinzessinnen und Prinzen. Zwei Messingkapseln, die an der Decke des vorderen Raumes befestigt sind, enthalten die Herzen der Hessenprinzen Georg und Philipp (beides Söhne Ludwigs VI.), die im Ausland ums Leben kamen.

Interessant ist das Bildprogramm an der Decke der beiden Grabräume. Vom Knochenmann mit Schlange und Apfel direkt am Eingang der Gruft (Symbol des Todes, der laut Genesis 3 durch den Sündenfall Adams und Evas in die Welt kam) über die Grablegung, Auferstehung und Himmelfahrt Jesu bis zu einer Darstellung des Jüngsten Gerichts werden die BesucherInnen durch die wesentlichen Stationen der Heilsgeschichte geführt. Sie werden so im Sinne eines memento mori an den eigenen Tod und die eigene Sterblichkeit erinnert, gleichzeitig wird ihnen aber auch die Hoffnung auf die Auferstehung zum ewigen Leben vor Augen geführt.